Die DNA-Base Cytosin wird bei kovalenter Modifikation am Kohlenstoffatom fünf (C-5) des Pyrimidinringes durch eine Methyltransferase so verändert, daß die resultierende 5-Methylcytosin-Formation ganz besondere, für diese Base einzigartige Eigenschaften erhält. Im Gegensatz zu den in der Genetik häufig verwendeten Organismen Drosophila, Saccharomyces, Caenorhabditis ist die enzymatische Cytosin-Konversion zur Zeit die einzige bekannte epigenetische Modifikation in Vertebraten. Es wurde bewiesen, daß sie eiene wichtige Rolle Embryonalentwicklung spielt (Bird, 1992; Li et al., 1992). Schon während der frühen Embryonalentwicklung eines Säugetiers werden Gameten-spezifische Methylierungsmuster auf bisher kaum verstandenen Mechanismen zu Zell-spezifischen, somatischen Methylierungsmustern (Razin und Cedar, 1993). Die Embryonalentwicklung geht während dem 4 - und 64 - Zellstadium mit einem stark reduziertem Methylierungsgrad einher. Etwa zur Zeit der Implantation wird das Genom dann, durch intensive de novo Methylierung remethyliert. Während der weiteren Entwicklung des Embryos können bestimmte Bereiche der DNA einer weiteren, gewebespezifischen Veränderung des Methylierungsmusters unterliegen (Bestor & Tycko, 1996; Turker & Bestor, 1997).
Die Cytosin-Methylierung findet vorwiegend symmetrisch an beiden DNA-Strängen des 5'-CpG-3'-Palindroms statt (Gruenbaum et al., 1982; Bestor & Ingram, 1983; Simon et al., 1983). Es wurde jedoch auch festgestellt, daß Pflanzen Cytosin-Basen in der Sequenz 5'-CpNpG-3' methylieren und Säugetierzellen die Fähigkeit besitzen, 5'-CpNpG-3'-Triplets in transfizierten Plasmiden zu modifizieren, wobei N jede der vier natürlich vorkommenden Hauptbasen sein kann (Gruenbaum et al., 1981; Clark et al., 1995). Die meisten Daten über die Distribution von methylierten Cytosinen kamen fast ausschließlich von Studien mit methylierungssensitiven Restriktionsenzymen (Bird & Southern, 1978) oder durch genomische Sequenzierung, einer Methode, die auch die Methylierung einzelner Cytosin-Basen erfassen kann (Church & Gilbert, 1984; Saluz & Jost, 1989; Pfeifer et al., 1989). Beide Methoden waren jedoch nicht ausreichend sensitiv, um geringe Methylierungs-unterschiede zu quantifizieren. Mit der Entwicklung der genomischen Sequenzierung nach der Bisulfit-Methode (Frommer et al., 1992; Clark et al., 1994), die auch in dieser Arbeit angewendet wurde, konnten auch einzelne Methyl-Cytosine sensitiv erfaßt werden, die nicht Teil eines CpG-Dinukleotids sind. Solche ungewöhnlichen Methylierungsmuster fand man unter anderem in Pilzen (Selker et al., 1993; Goyan et al., 1994), Pflanzen (Meyer et al., 1994) und Säugern (Tasheva & Roufa, 1994).
Das Auftreten des 5-mCytosins in CpG-Dinukleotiden bewirkte im Laufe der Vertebraten-Evolution eine etwa fünffache Verringerung der CpG-Sequenz im Genom (Subak-Sharpe et al., 1964; Russel et al., 1976; Schorderet & Gartler, 1992). Obwohl es gegenüber anderen Sequenzen unterrepräsentiert ist, entstehen dennoch etwa ein Drittel aller Punktmutationen in Krebs- und Keimbahnzellen an CpG-Dinukleotiden (Koeberl et al., 1990; Jones et al., 1992; Spruck et al., 1993). Die Methylierung spielt möglicherweise eine Rolle bei der C à T, respektive auf dem Gegenstrang G à A Transition (Rideout et al., 1990; Sved & Bird, 1990). Die hydrolytische Desaminierung von Cytosin führt zu Uracil, welches relativ effizient durch die Uracil-Glycosylase erkannt und entfernt werden kann (Lindahl, 1982).
Die Rate der Desaminierung von 5m-Cytosin ist in doppelsträngiger DNA jedoch 2- bis 3-mal höher, als die von Cytosin (Shen et al., 1994) und führt zur Bildung von Thymin. Die resultierende G:T Fehlpaarung ist schwieriger zu reparieren als die G:U Fehlpaarung (Coulondre et al., 1978). Des weiteren zeigen Experimente an den HpaII- und EcoRII-Methyltransferasen, daß diese Enzyme eine der hydrolytischen Desaminierung bis zu 10.000- fachen C à U Transition katalysieren und anschließend eine Methylgruppe auf Uracil übertragen können und so Thymin erzeugen (Wyszynski et al., 1994; Yang et al., 1995).
Da das zelluläre Reparatursystem eine Effizienz von nur etwa 90% besitzt (Brown & Jiricny, 1987; Wiebauer & Jiricny, 1990), kam es im Laufe der evolutiven Säugetier-Entwicklung somit zu einem bedeutenden Verlust an CpG-Dinukleotiden. Dennoch finden sich im Säugetiergenom Bereiche, die eine erhöhte GC-Dichte (~ 60-70 %) aufweisen und besonders reich an CpG-Segmenten sind (>30 CpG/500 nt). Solche in "CpG-reichen" Regionen liegende CpG-Dinukleotide sind gegenüber CpG-Motiven in "CpG-armen" Regionen mit einem GC-Gehalt von ~ 40 % seltener Ziel einer Methylierung . Sie besitzen zudem nur eine CpG-Dichte von einem Viertel, der abhängig von der Basenkomposition erwarteten Frequenz (Matsuo et al., 1993; Antequera & Bird, 1993). Diese ursprünglich als "HpaII tiny fragment (HTF) islands" definierten Segmente werden auch als "CpG-Inseln" bezeichnet, obwohl keine einheitlichen, auf alle diese Regionen zutreffende Attribute existieren. CpG-reiche Bereiche finden sich häufig 5'- assoziiert mit Promotern von "housekeeping"- und von gewebespezifisch exprimierten Genen (Larsen et al., 1992) und reichen meist bis zum transkribierten Bereich des assoziierten Gens. Typischerweise besitzen sie eine Länge von 0.5 bis 2 kBb (Kilo-Basenpaare) und entsprechen somit in ihrer Gesamtheit annäherungsweise 1-2 % des menschlichen Genoms (Bird, 1986). CpG-Gruppierungen schwanken jedoch zwischen verschiedenen Arten; Fische besitzen sogenannte "GC-arme CpG-Inseln" mit niedrigem GC-Gehalt (Crosset et al., 1991), aber auch die einzelnen Spezies der Säugetiere zeigen Unterschiede. Ein paarweiser Vergleich 23 orthologer Gene in Mensch und Maus zeigte, daß Mäuse fast immer geringer ausgeprägte oder gar keine CpG-reichen Regionen besaßen (Aï ssani & Bernardi, 1991a,b; Matsuo et al., 1993; Imoto et al., 1994). Weitere Eigenschaften, die für die Funktion CpG-reicher Regionen notwendig sein könnten, sind hypoacetyliertes Chromatin, das Fehlen von Histon H1 und Nucleosomen (Tazi & Bird, 1990) sowie ihre vermehrte Lokalisation in R-Banden und eine ihrer Untergruppen, den T-Banden (Holmquist, 1992; Craig & Bickmore, 1994).
Das Interesse an der DNA-Methylierung wuchs mit der Erkenntnis, daß der Informationsgehalt der DNA durch diese Modifikation erhöht wird und vielerlei Funktionen entfalten kann. So verbindet man die veränderte Genexpression einiger Erbkrankheiten (Bates & Lehrach, 1994; Schuffenhauer et al., 1995) und bei der Krebsentstehung mit der DNA-Methylierung (Baylin et al., 1991). Einige der assoziierten Gene sind Ziel einer gametischen Prägung ("genomic Imprinting"; Hall, 1990; Efstradiadis, 1994) oder X-Inaktivierung (Migeon, 1994; Details siehe Diskussionteil) und befinden sich häufig in einem reprimiertem Status, charakterisiert durch eine Methylierung der Promotor-Region (Bestor, 1995; Bird, 1995). Die codierenden Regionen vieler Gene sind unabhängig von ihrer Expression moderat bis hoch methyliert, ähnlich wie bei repetitiven Sequenzen, so zum Beispiel auch im Falle des Alu-Elements der Primaten (Schmid & Jelinek, 1982). Alu-Elemente sind CpG-reich und gewöhnlich hoch methyliert in weiblichen Gameten (Rubin et al, 1994) und somatischen Geweben (Kochanek et al., 1993; Hellmann-Blumberg, 1993). Die Funktion der Methylierung wird dabei mit der gehemmten Transkription der Alu-Elemente in Verbindung gebracht (Liu & Schmid, 1993). Weitere hypothetische Funktionen der DNA-Methylierung sind: Regulierung der Genexpression während der Embryonalentwicklung (Holliday & Pugh, 1975; Riggs, 1995; Li et al., 1992), Kontrolle der DNA Replikation (Taylor, 1984; Kawame et al., 1995), DNA-Reparatur (Clearer, 1995) und als Schutzmechanismus des Säugergenoms gegen parasitäre Sequenzen (Doerfler, 1981; Bestor, 1990). Möglicherweise wirkte dieser Mechanismus durch Hemmung der Transkription ursprünglich als Verteidigung gegen exogene, virale Sequenzen (Doerfler, 1991). Dieser Abwehrmechanismus konnte sich weiter zur Repression repetitiver Sequenzen und Retrotransposons adaptieren, mit einer weiteren Entwicklung bis zur Kontrolle der Genexpression (Übersicht bei Doerfler, 1983, 1989 ,1993 ,1995) und eventuell der gametischen Prägung (Barlow, 1993).
Das zentrale Element bei der Etablierung und Erhaltung der Methylierungs-Muster ist die DNA-Methyltransferase (Riggs, 1975; Wigler et al., 1981). Bisher sind mehr als 50 prokaryontische Methyltransferasen (MTasen) bekannt, während in Säugetieren jeweils nur eine MTase beschrieben wurde (Bestor et al., 1988; Yen et al., 1992; Rouleau et al, 1992). Die bakteriellen MTasen sind Teil eines Restriktions-Modifikationssystems und übernehmen eine wichtige Rolle in der Markierung der DNA (Schutzmechanismus gegen Fremd-DNA). Verschiedene Methylierungsvorgänge in den Zellen, wie die Etablierung gewebespezifischer Methylierungsmuster und deren klonale Weitergabe, legen die Vermutung nahe, daß mindestens zwei verschiedene Typen von Methyltransferasen existieren (Bolden et al., 1984; Jahner & Jaenisch, 1985). So wird die klonale Weitergabe der Methylierungsmuster von einer Erhaltungsmethylase-Aktivität gewährleistet, die hemimethylierte DNA als Substrat verwendet. Der parentale DNA-Strang dient bei diesem Prozess als Matrize. Zusätzlich zu dieser MTase-Aktivität konnte demonstriert werden, daß Fremd-DNA, die in ein etabliertes Säugetiergenom integriert, de novo methyliert werden kann (Sutter & Doerfler, 1979, 1980; Vardimon et al., 1980). Obwohl mehrere spezifische Nukleotidsequenzen identifiziert werden konnten, an denen de novo Methylierung bevorzugt initiiert wird (Mummameni et al., 1993; Brandeis et al., 1994) konnten Studien an integrierten Adenovirus Typ 12 (Ad12)-Genomen zeigen, daß bestimmte Sequenz-Motive nicht alleine für die Erkennung der Initiationsstelle verantwortlich sein können (Orend et al., 1995).
Genomic Imprinting resultiert in der bevorzugten Expression eines Allels, abhängig davon, von welchem Elternteil das Allel stammt. Es wird mit einigen Krankheitssyndromen assoziiert, wie z.B. Prader-Labhardt-Willi-, Beckwith-Wiedeman- oder Angelman-Syndrom. Innerhalb der letzten Jahren wuchs das Interesse an dem Imprinting-Phänomen, als erkannt wurde, daß nicht alle Aspekte der Vererbung mit den Mendelschen Gesetzen adäquat erklärt werden konnten. "Genomic Imprinting" ist ein reversibler Prozeß in diploiden Säugetierzellen, bei dem gameten-spezifische Modifikationen in der Parentalgeneration zu funktionalen Unterschieden zwischen dem maternalen und dem paternalen Genom in den Nachfahren führen können. Das transkriptionell inaktive Allel wird gewöhnlich als das funktionell vom Imprinting betroffene Allel bezeichnet, obwohl nicht auszuschließen ist, daß in manchen Fällen das primäre Imprint von dem aktiven Allel getragen wird.
Weitere häufig verwendete Synonyme sind: gametic-, parental-, chromosomal-, gene-, genetic-Imprinting oder nur einfach Imprinting; ein auch in deutschsprachigen, populärwissenschaftlichen Artikeln (Miketta, 1998) in seiner englischen Form verwandt. Zur Zeit existiert noch kein gebräuchlicher deutschsprachiger Ausdruck, sicherlich weil Verwechslungen mit ähnlichen Begriffen, wie Verhaltens-, hormonelle- und molekulare- Prägung leicht möglich sind. Um Mißverständnisse mit anderen Ausdrücken zu vermeiden, schlage ich vor, zukünftig für deutschsprachige Abhandlungen "Gametische Prägung" als Bezeichnung zu verwenden. Um eine genaue Definition des Imprinting-Phänomens zu gewährleisten ist es zudem unerläßlich, daß eine Unterscheidung eines gametisch geprägtem Allels mit anderen mono-allelisch exprimierten Genen gegeben ist. Für einige Zellen des Immunsystems und der olfaktorischen Neuronen ist die mono-allelische Expression einiger Gene (Immunoglobuline, T-Zell-Rezeptoren, NK-Zell-Rezeptoren, Interleukin-2, olfaktorische Rezeptoren), ein notwendiger Mechanismus, um nur eine bestimmte Rezeptor-Art auf ihrer Oberfläche zu präsentieren. Dieses Phänomen wird im Gegensatz zur gametischen Prägung als "Allel-Auschluß" (allelic exclusion) bezeichnet. Konträr zu dem Mechanismus in gametisch geprägten Genen, wird daß das zu inaktivierende parentale Allel zufallsmäßig ausgewählt.
Kern-Transfer-Experimente (McGrath & Solter, 1984) und die Untersuchung von Expressionsmustern verschiedener chromosomaler Regionen (Cattanach & Kirk, 1985) zeigen deutlich, daß die väterlich und mütterlich vererbten Gameten funktionell nicht identisch und die Präsenz beider für eine normale Entwicklung eines Säugetierorganismus notwendig sind. Schon die frühe Entwicklung des Maus-Embryos zum Blastocystenstadium benötigt beide Allele. Experimente ausgehend von androgenetischen (zwei paternale Allele) oder gynogenetischen (zwei maternale Allele) Eizellen zeigten, daß alle Embryos mit zunehmender Entwicklung absterben (Surani et al., 1986; Latham & Solter, 1991). Die Entwicklung dieser Embryos weist einige Unterschiede auf. So fällt bei androgenetischen Embryos eine besonders schwache Entwicklung der inneren Zellmasse (IZM) auf, aus der sich später der gesamte Embryo und seine Anhangsorgane, wie Nabelblase und Harnsack entwickeln, während die Entwicklung des Trophoblasten (Ernährungsgewebe und spätere Plazenta) phänotypisch normal verläuft. Eine exakt konträre Entwicklung der verschiedenen Zellmassen beobachtet man in gynogenetischen Embryos. Ob und im welchem Umfang schon zu diesem frühen Zeitpunkt der Entwicklung gametisch geprägte Gene exprimiert werden, ist aufgrund gegensätzlicher Ergebnisse mehrerer Untersuchungen noch relativ unklar. Das für die frühe embryonale Entwicklung am besten untersuchte Gen, welches offensichtlich einer gametischen Prägung unterliegt, ist das Igf2-Gen (Insulin-like growth factor II). Es wird außer im Choroid Plexus des Gehirns (DeChiara et al., 1991) gewöhnlich nur von dem väterlichen Allel exprimiert. Gen-Expressionsstudien an frühen Blastocystenstadien (Tag 3.5) in Mäusen zeigten keine Expression des Igf2 (Lee et al., 1990; Latham et al., 1994) oder eine Expression beginnend vom Zeitpunkt des Blastocystenstadiums (Szabó & Mann, 1995a,b). Andere Arbeiten (Rappolee et al., 1992; Lighten et al., 1997) deuten auf eine Expression in Maus und Mensch schon im Prä-Implantations-Embryo (<Tag 4.5) hin. Eine Expression der gametisch geprägten Gene H19, Mash2, Xist und Igf2r scheint schon vor der Implantation zu erfolgen, wechselt jedoch zwischen Tag 4.5 und Tag 7 nach der Befruchtung der Eizelle von bi-allelischer zu mono-allelischer Expression (Guillemot et al., 1995; Tremblay et al., 1995; Latham, 1996; Lerchner & Barlow, 1997). Wie diese Regulation funktioniert, ist zur Zeit nicht bekannt; jedoch scheint die Methylierung der DNA eine wichtige Rolle zu spielen (siehe nächster Abschnitt). Auch nach der embryonalen Entwicklung wirkt sich die gametische Prägung im Säugetiergenom aus. Ein Defekt im Imprinting-Prozess kann so zu verschiedenen Mißbildungen und Tumoren (Wilms Tumor) oder auch Erbkrankheiten wie Prader-Willi- und Angelman-Syndrom führen. Zur Zeit sind etwa 30 Gene bekannt, die einem Imprint unterliegen (siehe Tab.1).
Tabelle 1: Imprinted Gene und Loci in Mensch und Maus
|
Gen (Locus) |
Expression Mensch Maus |
|
|
(TNDM) t |
m |
- |
|
CEB15 M |
m? |
- |
|
Grf1 |
- |
p |
|
H19 |
m |
m |
|
Htr2 |
- |
m |
|
Igf2 |
p |
p |
|
Igf2r |
x |
m |
|
Ins 1 |
- |
(p) |
|
Ins 2 |
- |
p |
|
IPL |
m |
m |
|
IPW |
m |
- |
|
KVLQT1 (KCNA9) |
m |
- |
|
Mas |
p |
p |
|
Mash2(Hash2) |
- |
m |
|
mo-2 M M |
- |
(p) |
|
NDN |
p |
- |
|
Gen (Locus) |
Expression Mensch Maus |
|
|
Meg1 (Grb10) u |
- |
m |
|
p57KIP2(Cdkn1c) |
m |
m |
|
Par 1 |
m |
- |
|
Par 2 |
(p) |
- |
|
Par 5 |
m |
- |
|
Peg1/Mest |
- |
m |
|
Peg3/Pw1 |
- |
p |
|
Peg5/Neuronatin |
- |
p |
|
PGL1 b |
p |
- |
|
PGL2 b |
p |
- |
|
SNRPN |
p |
p |
|
U2afbp-rsU2af1-rs1 |
- |
p |
|
UBE3A |
m |
m |
|
WT1 |
m |
- |
|
Xist |
- |
p |
|
ZNF127 (Zfp127) |
p |
p |
M
Marker telomerisch zu N-myc (Caron et al., 1995); M M Sog. Macrosatellite (Takahashi et al., 1994); t Locus für Transient neonatal diabetes mellitus (TNDM) auf 6q22-23 (Temple et al., 1996); b PGL = Hereditary nonchromaffin paragangliomas auf 11q23 (PGL1) und 11q13 (PGL2) (Baysal et al., 1997); u Kandidat für Silver-Russel-Syndrom (Miyoshi et al., 1998); p = paternale Expression; m = maternale Expression; x = kein Imprint; - = keine Daten bekannt.
Welche Faktoren bei der Regulierung des Imprints eine entscheidende Rolle spielen, ist zur Zeit nicht genau bekannt; indes läßt sich vermuten, daß die DNA-Methylierung eine essentielle Komponente ist. Es ist eine anerkannte Tatsache, daß die beiden gegensätzlichen Gameten DNA-Regionen besitzen, die unterschiedlich methyliert sind (Monk et al., 1987; Sanford et al., 1987; Howlett & Reik, 1991). Zudem kann durch CpG-Methylierung, die Transkription beeinflußt werden; sie ist reversibel und bei somatischen Zellteilungen relativ stabil. Es ist dagegen unklar, ob die DNA-Methylierung ein primärer oder sekundärer Imprinting-Vorgang ist. Die Methylierungsmuster im Prä-Implantationsembryo scheinen durch ein Welle genomweiter Demethylierung ausgelöscht zu werden (Frank et al., 1991; Kafri et al., 1992), jedoch ist nicht auszuschließen, daß kleine Bereiche gametenspezifisch methyliert bleiben. Frühe Untersuchungen, ob DNA-Methylierung mit einem funktionalem Imprint korreliert, nutzten methylierungssensitive Restriktionsenzyme, die parentale Allele an RFLPs (Restriction fragment length polymorphism) erkennen. So konnte gezeigt werden, daß in Embryos und post-embryonalen Geweben das inaktive Allel, wie in den gametisch geprägten Genen H19, Igf2r, SNRPN, Xist und U2af-bprs gewöhnlich methyliert ist (Brandeis et al., 1993; Ferguson-Smith et al., 1993; Ariel et al., 1995; Glenn et al., 1996). Man fand jedoch auch ein gametisch geprägtes Gen (KIP2), in dem das transkriptionell ruhende Allel keine Hypermethylierung aufweist und mehrere CpG-Dinukleotide über die ganze Region des Gens auf beiden Allelen unmethyliert bleiben (Chung et al., 1996). Eine abweichende Methylierung und damit verbunden ein funktional geändertes Imprint in den parental geprägten Genen kann zu verschiedenen Krankheiten wie embryonale Rhabdomyosarkomen, Wilms Tumor, Beckwith-Wiedeman- , Prader/Willi- oder Angelman-Syndrom führen (siehe unten).
Das die DNA-Methylierung mit dem Imprinting-Mechanismus korreliert zeigt, daß das 5-Azacytidin (aza-C), ein kovalenter Inhibitor der DNA-Methyltransferase, in der Lage ist, ein funktionales Imprint verändern zu können (Riggs & Jones, 1983). So wurde beobachtet, daß aza-C in verschiedenen Tumor-Zellinien die Expression von H19 und die damit verbundene reziproke Abwärts-Regulation der Igf2-mRNA induzieren kann. Die Tatsache, daß allelspezifische DNA-Methylierung sich auf ein Imprint auswirkt, kann jedoch nicht zeigen, daß sie auch für die Etablierung einer gametischen Prägung nötig ist. Analysen der X-Chromosom-Inaktivierung konnen zeigen, daß eine weitreichende Methylierung der mit Chromatinstruktur-Änderungen einhergehenden Gen-Inaktivierung nachfolgt und somit wahrscheinlich zumindesten für die X-Inaktivierung kein Primär-Faktor ist (Lock et al., 1987). Dem entgegengesetzt scheinen jedoch einige CpG-Dinukleotide, der genomweiten Demethylierung zu entgehen. Das H19 Gen ist gewöhnlich in Spermien stärker methyliert als in Oozyten (Zhang et al., 1993; Bartolomei et al., 1993) und zumindestens eine HpaII-Erkennungssequenz des väterliche vererbten H19-Allels scheint seine Methylierung über das Blastocystenstadium hinaus beizubehalten (Tremblay et al., 1995). Eine ähnliche Beobachtung konnte bei einigen CpG-Dinukleotiden des Igf2r-Gens gemacht werden, die ihre maternale Methylierung behalten können (Stöger et al., 1993). Welchen Teil des Imprinting-Prozesses die Methylierung einnimmt, müssen daher weitere Studien an Chromatin, Gameten-Methylierung und eventuell DNA-Protein-Wechselwirkungen zeigen.
Bisher existieren experimentelle Daten zur Nuklease-Empfindlichkeit zu den gametisch geprägten Mausgenen Igf2, H19 und U2af1-rs1 aus Kern-Extrakten. Mit dieser Methode lassen sich Nuklease-hypersensitive Stellen und kleine Nukleosomen-freie Regionen identifizieren, die häufig mit cis-regulatorischen Sequenzen aktiver Gene assoziiert sind (Gross & Garrard, 1998). Alle paternal methylierte Allele in U2af1-rs1 zeigten eine größere Sensitivität gegenüber Behandlung mit DNaseI und Endonuklease MspI (Feil et al., 1997). Ähnliche Ergebnisse zeigten Arbeiten an den X-chromosomalen Genen HPRT und PGK-1, in denen die DNaseI und MspI-Sensitivität auf dem aktiven X-Chromosom am höchsten ist (Wolf & Migeon, 1985; Riley et al., 1986). Ihre Empfindlichkeiten bezüglich einer Mikrococcus-Nuklease-Behandlung (MNase) sind nahezu identisch, was darauf hinweist, daß beide Gene möglicherweise eine ähnliche Nukleosomen-Struktur besitzen. Eine andere Eigenschaft dieser hoch-exprimierten Bereiche ist, daß sie in der S-Phase des Zellzyklus früher repliziert werden (Holmquist et al., 1987). Eine asynchrone Replikation wurde durch direkte cytogenetische Analysen in der Prader-Willi- Region (Izumikawa et al., 1991) und durch FISH-Analysen an Interphase-Nuklei in der Igf2-H19-Region nachgewiesen (Kitsberg et al., 1993; Knoll et al., 1994). Interessanterweise scheinen diese chromosomalen Replikationsmuster die Beteiligung beider parentaler Allele zu benötigen (LaSalle & Lalande, 1995). Ein anderes Merkmal dieser Regionen ist die Hypo-acetylierung des Kern-Histons H4 (Jeppesen & Turner, 1993; Jeppesen, 1997), ein Charakteristikum, welches möglicherweise zur Dekondensation des Chromatins führen kann (van Holde & Zlatanova, 1996).
Erste Hinweise auf eine Rolle des Imprinting-Prozesses in der Entstehung von Krebs lieferten 1988 Daten von Wilkins, die zeigten, daß in Wilms-Tumoren ein charakteristischer Verlust des mütterlichen Allels von Chromosom 11 zu finden war (loss of heterozygosity, LOH). Auch in anderen embryonalen Tumoren konnte die besondere Beteiligung eines parentalen Allels nachgewiesen werden, so in Neuroblastomen (Caron et al., 1993; Cheng et al., 1993) und Rhabdomyosarkomen (Scrable et al., 1989). Ähnliche Tumor-Formen scheinen nicht nur auf embryonales Gewebe beschränkt zu sein. Die Entstehung von bestimmten Lungen-Tumoren wurde mit einem defekten Imprint des Igf2-Gens in Verbindung gebracht (Suzuki et al., 1994). Neben der Turmor-Entstehung scheint auch an dem Auftauchen spezifischer Wachstumsstörungen ein defekter Imprinting-Mechnismus beteiligt zu sein. Das wohl bekannteste ist das Beckwith-Wiedemann Syndrom (BWS). Es wurde unabhängig voneinander von Beckwith (1963) und Wiedemann (1964) entdeckt und wird auch als EMG-Syndrom (Exomphalos-Makroglossie-Gigantismus-Syndrom) bezeichnet. In vielen BWS-Patienten finden sich neben Wilms Tumoren auch Zucker-Stoffwechselstörungen, die offensichtlich durch eine Überproduktion von Insulin (INS) oder "Insulin-like growth factor 2" (Igf2)-Genen verursacht werden (Engström et al., 1988). Zahlreiche Daten deuten darauf hin, daß viele dieser Störungen ihren Ursprung in der gametisch geprägten Chromosomenregion 11p15, innerhalb der Igf2-H19-Region haben (Ping et al., 1989; Rechler & Nissley, 1990; Mannes et al., 1994).
Das Prader-(Labhart)-Willi Syndrom (PWS) ist mit einer Häufigkeit von etwa 1:12500 (West-Europa) die häufigste genetisch bedingte Ursache von Fettleibigkeit und wurde zuerst 1956 von Andrea Prader und Kollegen A. Labhart und H. Willi von der Universitätskinderklinik Zürich beschrieben (Prader et al., 1956). Es handelt sich um ein Syndrom von Kleinwuchs, Adipositas, Imbezillität (angeborener Schwachsinn) und Hypogonadismus mit anfänglich im frühen Säuglingsalter auffälliger Muskelhypotonie, die sich darin äußert, daß die Kinder nahezu unbeweglich verharren und weder schreien noch saugen können (Übersicht in Holm et al., 1993). Für Jahrzehnte lag die Ursache dieser Krankheit völlig im Dunkeln, bis gehäuft über Translokationen und kleiner Deletionen auf Chromosom 15 in PWS-Patienten berichtet wurde (Ledbetter et al., 1981, 1982). Etwa 70% der PWS-Patienten besitzen eine Deletion des paternalen Chromosoms 15q11-q13 (Nicholls et al, 1989b), während Patienten, denen das mütterliche Allel fehlt, ein anderes Krankheitsbild, das Angelman Syndrom, entwickeln (siehe unten). Weitere Studien (Nicholls et al., 1989a, 1993; Mascari et al., 1992) zeigten, daß etwa 25% der PWS-Patienten zwei normale Chromosomen besaßen, die jedoch beide mütterlichen Ursprungs waren (sog. Uniparentale Disomie, UPD). Viele solcher Befunde lieferten die Grundlage zu der Annahme, daß das PWS-Syndrom der gametischen Prägung unterliegt und die vermutlichen PWS-Gene nur auf dem väterlichen, die AS-Gen(e) nur auf dem mütterlichen Chromosom aktiv sind. Desweiteren finden sich bei etwa 5% der Patienten andere chromosomale Abnormalitäten oder ein Defekt im Imprinting Mechanismus (Hamabe et al, 1991a,b; Knoll et al., 1993, Zackowski et al., 1991; Horsthemke et al., 1995).
Die kritische PWS-Region ist zur Zeit auf etwa 3 Mb eingegrenzt (siehe Übersichtskarte, Abb. 6) und umspannt sechs bisher bekannte Gene, die paternal exprimiert werden: SNRPN (Özcelik et al., 1992; Glenn et al., 1993; Nakao et al., 1994), PAR1 und PAR5 (Sutcliffe et al., 1994), NDN (Jay et al., 1997), ZNF127 (Özçelik et al., 1992) und IPW (Wevrick et al., 1994). Das SNRPN-Gen codiert für das kleine nukleare Ribonukleoprotein N, welches an dem Spleiß-Mechanismus der RNA beteiligt ist. IPW scheint nur für ein RNA-Produkt zu codieren, während die Funktion der PAR1- und PAR5-Transkripte bisher vollkommen unbekannt ist. NDN ist ein Intron-loses, zum Neuron-spezifischen Necdin-Gen der Maus homologes Gen, während das ZNF127 für ein Zink-Finger-Protein, unbekannter Funktion codiert.
Der Mechanismus, mit dem diese Gene allelspezifisch exprimiert werden, ist unbekannt, jedoch scheinen Chromatin-Kondensierung (Ferguson-Smith et al., 1993), zeitliche Replikations-Steuerung (Izuikawa et al., 1991; Kitsberg et al., 1993; Knoll et al., 1994) und DNA-Methylierung (Driscoll et al., 1992; Dittrich et al., 1992, Buiting et al., 1994) involviert zu sein.
Der weitaus größte Teil der CpG-Dinukleotide in der PWS-Region scheint maternal methyliert und paternal unmethyliert zu sein (Dittrich et al., 1992, 1993; Zeschnigk et al., 1997). Indes finden sich auch einzelne HpaII-Erkennungssequenzen, so auch im Intron 5 des SNRPN-Genes, die auf dem paternalen, jedoch nicht auf dem maternalen Chromosom methyliert sind (Glenn et al., 1993b, Buiting et al., 1994). Einige Prader-Willi Patienten zeigen eine von diesem Muster abweichende Methylierung, besitzen jedoch anscheinend normale Chromosomen biparentalen Ursprungs (Glenn et al., 1993a; Reis et al., 1994a; Buiting et al., 1994). Man fand ein maternales Methylierungs-Imprint auf dem paternalen Chromosom oder ein paternales auf dem maternalen Chromosom. Es zeigte sich, daß diese Patienten kleine Mikrodeletionen besaßen, lokalisiert in einem Abschnitt der DNA, welcher daraufhin als Imprinting-Zentrum bezeichnet wurde (Details siehe Ergebnisteil). Da die Methylierung in 15q11-13 mit der Expression reziprok zu korrelieren scheint, könnten die betroffenen PWS-Gen(e) oder die ganze PWS-Region durch einen bisher unbekannten Mechanismus kontrolliert sein.
Das Angelman Syndrom wurde zuerst 1965 von dem englischen Kinderarzt Dr. Harry Angelman beschrieben. Er beschrieb drei Kinder mit stark ausgeprägtem Schwachsinn, einer Hypopigmentation, Störung der Bewegungsfunktionen und anderen Charakteristika wie ein typisch glückliches, der Situation nicht angepaßtes Erscheinungsbild (Ausbrüche von Lachen), die ihn dazu bewegten, die Kinder als sogenannte "puppet children" zu bezeichnen (Angelman, 1965). Die Krankheit ist im frühen Kindesalter schwer zu diagnostizieren, daher schwanken auch die Angaben über die Häufigkeit dieses Syndroms zwischen 1:12000 (Kyllerman, 1995) über 1:16000 in West-Berlin (Reis et al, 1994b) bis zu weit über 1: 20000 (Clayton-Smith et al., 1992). Es wurde vielfach diskutiert, ob mögliche frühere Veröffentlichungen zu Angelman-Patienten existieren, die irrtümlich als Down-Syndrom diagnostiziert wurden, da insbesondere atypische Fälle mit milderem Phänotyp bekannt sind (Boyd et al., 1988; Bottani et al., 1994).
Die Angelman Patienten sind dadurch charakterisiert, daß sie nie lernen, sich sprachlich zu artikulieren (meist weniger als sechs erlernte Worte), sie neigen zu epileptischen Anfällen, Brachyzephaly (Kopfumfang meist <50 cm), Hyperaktivität, atypisches EEG und unverkennbar phänotypische Gesichtsformen, hervorgerufen durch tiefliegenden Augen, weitem Mund und weit auseinanderstehenden Zähnen (Williams & Frias, 1982; Baraitser et al., 1987; Robb et al., 1989; Zori et al., 1992; Clayton-Smith et al., 1993).
Im Gegensatz zum Prader-Willi Syndrom fehlt Angelman-Patienten meist ein Teil des maternalen Chromosoms 15q11-13. Etwa zwei Drittel der Patienten haben de novo Deletionen (Kaplan et al., 1987; Magenis et al., 1987), die immer das mütterliche Allel betreffen (Knoll et al., 1989) während beim PWS (~ 25% maternale UPD) nur 1-3% der beobachteten Fälle aus einer paternalen UPD (zwei väterliche Chromosomen) resultieren. Diese Diskrepanz läßt sich durch die soenannte. "disomic rescue" des maternalen Chromosoms während einer potentiellen Trisomy 15 und des vornehmlichen meiotischen, maternalen Ursprungs nicht voneinander getrennter Chromosomen erklären (Cassidy et al., 1992). Weitere 7-9% der Angelman-Patienten scheinen einen Defekt im Imprinting-Prozeß zu besitzen (Saitoh et al., 1996), der eng mit dem Imprinting-Mechanismus des Prader-Willi Syndroms gekoppelt sein könnte, da Deletionen zentromerisch zu dem möglichen PWS-Imprinting-Zentrum zu einem veränderten Imprint führen können (Bereich AS-SRO, siehe Karte zum IC-Element Abbildung 7). Beide Regionen scheinen zusammen ein einziges, in zwei unterschiedlichen Richtungen wirkenden Imprinting-Center (IC) zu bilden, welches durch Deletion die Fähigkeit verlieren könnte, in der weiblichen Keimbahn den Wechsel des paternalen Imprints zum maternalen zu vollziehen (Dittrich et al., 1996), d.h. das Angelman-Syndrom könnte durch das Fehlen der Expression maternaler, das Prader-Willi Syndrom durch das Fehlen der Expression paternaler Gene hervorgerufen werden.
Die restlichen 10-18% der von diesem Syndrom betroffenen Personen scheinen eine Mutation in einem einzelnen Gen auf 15q11- 13 zu besitzen. Die für AS kritische Region ist zur Zeit auf etwa 600 kb eingegrenzt und umfaßt die drei bekannten Transkripte Par-2 (D15S225), Par-4 und UBE3A (E6-AP) (siehe Übersichtskarte, Abb. 6). Die Funktion der Par-2 und Par-4-Transkripte ist bisher unbekannt. Als möglicher Kandidat für die Entstehung des Angelman-Syndroms gilt hingegen das UBE3A-Gen, welches eine Ubiquitin-Protein Ligase codiert. Das UBE3A-Protein transportiert Ubiquitin innerhalb des sog. "Ubiquitin- proteosome proteolytic pathway" zu Protein-Substraten. Ein Verlust dieser Enzym-Funktion durch Mutationen in der codierenden Region des Gens wurde in Patienten nachgewiesen (Hochstrasser, 1996; Kishino et al., 1997). Das Imprint des Gens und damit seine uniparentale, spezifische Expression des maternalen Allels konnte jedoch nur in Gehirngewebe (insbesondere Hippocampus- und Purkinje-Neuronen) nachgewiesen werden (Albrecht et al., 1997; Vu & Hoffman, 1997; Rougeulle et al., 1997). Weiter telomerisch zur UBE3A-Region liegt das P- Gen, welches mit einem Tyrosin-positiven (Typ II)-oculocutanen Albinismus korreliert und somit wahrscheinlich die Ursache für die Hypopigmentation in einigen Angelman-Patienten ist (Ramsay et al., 1992). Das P- Gen wird vorwiegend in den, das schwarz-braune Pigment Eumelanin produzierenden Melanozyten exprimiert (Nicholls, 1993). Daten zur Methylierung in der Angelman-Region liegen zur Zeit nicht vor.
Mehrere Theorien zur evolutiven Entwicklung und Funktion des genomic Imprinting werden zur Zeit diskutiert. Beide Teile dieser Arbeit könnten eventuell zu einem besseren Verständnis der Imprinting-Theorie beitragen. Die am häufigsten diskutierte Theorie ist die "genetic conflict hypothesis" (Moore & Haig, 1991; Moore, 1991, 1992). Diese Theorie vereinigt das Phänomen von autosomalem Imprinting und X-Chromosom Inaktivierung und beschreibt die Entstehung des Imprints als ein Rennen der unterschiedlichen "Bedürfnisse" von maternal und paternal abstammenden Genen (Details siehe Disskusionsteil). Eine andere Theorie besagt, daß parentales Imprinting die Möglichkeit parthenogenetischer Reproduktion verhindert (Solter, 1988), indem es Fitness der anderen (sexuell gezeugten) Embryos mit dem gametisch geprägtem Allel erhöht. In anderen Hypothesen wird die besondere Rolle der Säugetier-Plazenta hervorgehoben. Hall (1990) schlug vor, eine mögliche Funktion des Imprintings liege darin das Wachstum der Placenta zu regulieren, während Varmuza und Mann (1994) vorschlugen, daß ein Imprinting-Mechanismus die Placenta vor möglichen Trophoblast-Tumoren schützen könnte, indem die für die Throphoblasten-Entwicklung benötigten Gene in den Oocyten inaktiviert werden.
Die Theorie der "Dominance modification" (Sapienza, 1989) besagt, daß die gametische Prägung nur ein Nebeneffekt anderer Funktionen der imprinted Regionen ist, da sonst ein Imprint alleine, selektiv nicht über viele Generationen erhalten werden könnte. Die "Host defense hypothesis" (Barlow, 1993) richtet die Aufmerksamkeit vielmehr auf die DNA-Methylierung. Diese Theorie befürwortet, daß die ursprüngliche Funktion von gametisch geprägten Loci die fremde DNA inaktivieren. Nach diesem Modell wurden einige Gene im Verlauf der Evolution Ziel einer Modifikation durch Methyltransferasen, weil diese Gene "imprinted boxes" enthielten, die aus Fremd-DNA bestanden. Die parental-spezifische Expression wäre demnach eine Konsequenz aus der vornehmlich in der maternalen Keimbahn stattfindenden DNA-Methylierung.
Andere Autoren erkären den Imprinting-Effekt einfach mit Gen-Regulation, liefern damit aber weniger eine neue Theorie des Imprinting-Phänomens als vielmehr eine Beschreibung des Imprinting-Vorgangs. Weiterhin erklärt eine alleinige Funktion des Imprintings als Gen-Regulator nicht, warum die meisten Lebewesen auf einen Imprinting-Mechanismus verzichten können. Eine genauere Erklärung zur Imprinting-Theorie im Kontext der Daten dieser Arbeit findet sich im Diskussionsteil.
Untersuchungen aus unserem Labor konnten zeigen, daß von Mäusen mit der Nahrung aufgenommene DNA im gastrointestinalen Trakt nicht vollständig degradiert wird und über das Darmepithel in den Blutkreislauf gelangen kann (Schubbert et al., 1994, 1997). Fragmente dieser DNA (M13 Bakteriophagen-DNA) konnten in Leukozyten, Leber- und Milzzellen nachgewiesen werden. Ist Fremd-DNA in eine Zelle eingedrungen, kann sie im Cytoplasma oder in den Organellen weiter abgebaut werden. Gleichwohl kann DNA in den Nukleus gelangen und in das Wirtsgenom integrieren, wo sie eventuell das Ziel einer de novo Methylierung (und damit verbundener Inaktivierung) wird. Werden z.B. Fragmente von Adenovirus Typ 12 (Ad12)-DNA in Säugetierzellen transfiziert, wird diese DNA nach Integration in das Wirtsenom in einigen Zellinien methyliert, in anderen jedoch nicht (Orend et al., 1995). Ein Faktor, der über das Schicksal eines so integrierten DNA-Fragmentes entscheidet, könnte die Position der Integrationsstelle sein. In einem möglicherweise ähnlichen Mechanismus wird in der Ad2-transformierten Zellinie HE1 (Cook & Lewis, 1979) Teile des Ad2-E2A-Promoters methyliert, nicht jedoch in der Zellinie HE2 (Toth et al., 1989, 1990). Da in ein Wirtsgenom integrierte DNA häufig Ziel einer de novo Methylierung ist, wurde für diese Methylierung von Transgenen und Fremd-DNA als zellulärer Verteidigungs-Mechanismus interpretiert (Doerfler, 1991). Eine von der Fremd-DNA provozierte Reaktion der Zellen kann sich offenbar auch auf die Methylierungs-Muster anderer Bereiche des Genoms auswirken, die weit von der Insertionsstelle entfernt liegen (Heller et al., 1995; Kämmer et al., 1998, in Veröffentlichung). Weitere Hinweise auf die Ursachen und Konsequenzen von einer Integration fremder DNA in ein etabliertes Genom lieferten Untersuchungen, die verschiedene Typen von Transgenen nutzten (siehe 1.3.2).
Das Phänomen des Genomic Imprinting wurde zuerst an Transgen-Loci im Mausgenom beobachtet (Reik et al., 1987; Sapienza et al., 1987; Swain et al., 1987). Weitere Studien an diesen Transgenen zeigten, daß zwei entscheidende Arten von Transgen-Imprinting Prozessen existieren: (1) Imprinting in Mausstämmen mit gemischten genetischen Hintergrund und (2) Imprinting in Inzucht-Stämmen. Ein Beispiel für (1) ist das CAT17-Transgen (Reik et al., 1987), welches im gemischten genetischen Hintergrund auf dem maternalen Allel hypermethyliert und auf dem paternalen nahezu vollständig unmethyliert ist. Wird dieses Transgen jedoch in einen Inzucht-Stamm (z.B. C57BL/6) hineingekreuzt, scheint das Transgen sein Imprint zu verlieren und wird auf beiden Allelen methyliert. Dieses Phänomen ließ sich wiederholt bei anderen Transgenen und Mausstämmen beobachten (Hadchouel, 1987; Engler et al., 1991; Sapienza et al., 1992; Chaillet et al., 1992; Allen & Mooslehner, 1992; Sasaki et al., 1993). Der Verlust der Imprint-Eigenschaft weist darauf hin, daß diese Transgene offenbar nicht selber einem Imprint unterliegen, sondern eher Indikatoren für endogene eltern-spezifische Effekte sind.
Andere Transgene vom Typ (2), wie z.B. MPA434 (Sasaki et al., 1991) oder RSVIgmyc (Chaillet et al., 1991) zeigen ein Keimbahn-spezifisches Imprint in homozygoten Balb/c- bzw. FVB/N-Stämmen. Methylierungs-Untersuchungen während der Embryonalentwicklung an beiden Transgenen (Ueda et al., 1992; Sasaki et al., 1993) konnten zeigen, daß beide Transgene sehr ähnlichen, Eltern-spezifischen Methylierungsänderungen unterworfen sind. In mitotisch aktiven und sexuell undifferenzierten, ursprünglichen Keimzellen des sich entwickelten Embryos sind beide Transgene vollständig frei von Methylierung. Offensichtlich findet während dieser frühen Entwicklungs-Phase eine genomweite Demethylierung statt, die damit erst eine Etablierung des neuen Eltern-spezifischen Imprints ermöglicht (Monk et al., 1987; Sanford et al., 1987; Kafri et al., 1992). Im Verlauf der weiteren Entwicklung wird das RSVIgmyc-Transgen in der männlichen Keimbahn bis zu einem bestimmten Grad methyliert, während MPA434 bis zur vollständigen Entwicklung des Spermiums unmethyliert bleibt. Anders verläuft die Entwicklung in den weiblichen Keimzellen. Beide Transgene werden dort hoch methyliert. Nach Befruchtung und abgeschlossener Embryogenese behält MPA434 diese Methylierung bei, während interessanterweise das paternale RSVIgmyc-Transgen-Allel nach der Befruchtung seine Methylierung verliert. Diese Methylierung der Transgene wird bis zum erwachsenen Tier beibehalten und korelliert mit Allel-spezifischer Expression (Swain et al., 1987). Das RSVIgmyc-Transgen zeigt diesen Imprinting-Effekt unabhängig von der Position, an der es in das Genom integriert, ein Hinweis auf einen mögliches in cis operierendes Imprinting-Signal, welches auf dem Transgen lokalisiert ist.
Ein von den beiden zuvor beschriebenen unterscheidbarer Imprinting-Typ ist bei dem TKZ751-Transgen beobachtet worden. Dieses Transgen ist komplett unmethyliert und zeigt eine hohe Expression, wenn es in einem DBA/2-Stamm gekreuzt wird (Allen et al., 1990). Ganz anders verhält sich der TKZ751-Locus, wenn er in einen genetischen Balb/c-Hintergrund eingeführt wird. Das Transgen wird methyliert und seine Expression unterbunden, möglicherweise, weil diese Mausstämme verschiedene Allele eines Genotyp-spezifischen "Modifiers" tragen, dessen Funktion und Eigenschaften jedoch unbekannt sind. Interessanterweise methyliert der Balb/c-Modifier das Transgen nur dann, wenn es von der Mutter weitervererbt wurde (DBA/2 ` 5 Balb/c a ), jedoch nicht, wenn vom Vater vererbt. Solch eine Vererbungs-Phänomen kann darauf hindeuten, daß der Modifier selber einem Imprint unterliegt. Ähnliche Eigenschaften wurden bei Experimenten mit dem Transgen CMZ12 (Surani et al., 1990) und dem endogenen Locus SPARC auf Maus-Chromosom 11 beobachtet (Reik et al., 1990).
In den meisten Fällen sind diese epigenetischen Veränderungen vererbbar und verstärken sich sukzessive über die Generationen. Nach drei aufeinanderfolgenden Kreuzungen mit Balb/c-Weibchen, erreicht das TKZ751-Transgen seine höchste Methylierung, welche auch nach wiederholtem Kreuzen in den nicht-methylierenden DBA/2-Hintergrund irreversibel erhalten bleibt (Allen et al., 1990). Ähnlich verhält sich das HbsAg E36-Transgen, welches schon nach einmaliger Kreuzung mit einem C57BL/6-Weibchen irreversibel methyliert wird (Hadchouel et al., 1987).
Einen weiteren Typ von modifizierten Transgenen repräsentiert das 7-1A-Transgen (Lettman et al., 1991; Koetsier et al., 1995, 1996), dessen Methylierungsmuster in dieser Arbeit untersucht wurden. Tiere der 7-1A-Linien zeigten ein Mosaik-Muster, welches stamm-spezifisch beeinflußt wird. Etwa 10% aller Tiere eines gemischten Hintergrundes (C57BL/6 5 DBA/2) zeigten eine Demethylierung des Transgens. Nach Einführung des hypomethylierten Transgens in einen reinen genetischen DBA/2-Hintergrund, behielt das Transgen seinen Methylierungsgrad bei. Wurde nun das 7-1A-Transgen in einen C57BL/6- oder Balb/c-Stamm gekreuzt, wurde es in allen Nachkommen de novo methyliert. Die Methylierung des Transgens ist jedoch nur abhängig vom genetischen Hintergrund. Eine Abhängigkeit der Transgen-Methylirung von der parentalen Herkunft wurde nicht beobachet. Es ist also nicht abhängig von der parentalen Herkunft per se und scheint somit keinem direkten Imprint zu unterliegen.
Verschiedene Untersuchungen an Fischen (Danio rerio)- und Säugetier-Systemen, gewöhnlich Mäusen, zeigten eine mögliche Existenz von in cis- und/oder trans-agierenden Modifiern der Transgen-Methylierung auf (Sapienza et al., 1989; Allen et al., 1990; Stuart et al., 1990; Forejt & Gregorowá, 1992; Martin et al., 1995). Diese Modifier scheinen an der Entstehung von dominanten Modifikation bei Transgenen, gametischer Prägung und zellulären Expressions-Mosaizismen entscheidend beteiligt zu sein. Verwendet man z.B. das Transgen TKZ751 (Allen et al., 1990) für eine Rückkreuzung von F1 (DBA/2 5 Balb/c)-Weibchen mit transgenen DBA/2-Männchen, erhält man in den Nachkommen sowohl methylierte, als auch unmethylierte Transgene. Kalkulationen zu der präzisen Verteilung der Methylierungs-Phänotypen (sogenannte Sewall-Wright Verteilung) lassen eine geringe Anzahl genetischer Faktoren vermuten, die für diese Effekte verantwortlich sein könnten. Augehend von den Segregations-Daten ließ sich ableiten, daß neben einigen möglichen kleineren Loci, eventuell ein dominantes Balb/c-Modifier-Gen existiert. Mit Hilfe von Mikrosatelliten-Analysen, konnte auf Maus-Chromosom 17 die mögliche Region identifiziert werden, in der sich der Balb/c-Modifier befindet (J. Walter, pers. Kommunikation). Weitere Analysen mit verschiedenen Markern, spezifisch für das proximale Chromosom 17 zeigten, daß in Abwesenheit dieses Allels (z.B. in homozygoten DBA/2-Tieren) zwei weitere Loci auf den Chromosom 2 und 4 eine Methylierung induzieren und somit gegebenenfalls additiv zum Chromosom 17-Locus wirken. Eine genaue Charakterisierung dieser Genom-Abschnitte ist bisher nicht erfolgt; jedoch scheint der Imprinting-Mechanismus schon sehr früh in der Entwicklung (etwa während des Blastocystenstadiums, Allen & Mooslehner, 1992) seine Wirkung auf das Genom auszuüben. Ein ähnlicher Modifier scheint die Methylierung des E36-Transgens zu steuern. Dieses Transgen zeigt eine erhöhte Methylierung, wenn es maternal an die Nachkommen weitergegeben wird. Wird es zusammen mit einem Balb/c-Allel (nicht jedoch mit DBA/2, Wu et al., 1992; C. Pourcel, pers. Kommunikation) weitervererbt, so kann das Transgen auch nach paternaler Transmission methyliert werden.
Bis zum heutigen Tag existiert somit noch kein überzeugendes Modell über die Wirkungsweise dieser Modifier oder über die molekulare Basis ihrer Funktion. Obwohl im Jahre 1991 Engler und Mitarbeiter ein möglicher stamm-spezifisches Modifier-Gen (Ssm1) auf Chromosom 4 (nahe Fv-1) lokalisierten, folgten keine weiteren Publikationen, die diesen Daten Nachdruck verleihen konnten.
Ein 1992 von Reik postuliertes Modell beschreibt die Möglichkeit, daß es sich bei diesen Modifiern entweder um verschiedene Allele von Methyltransferasen handelt oder das verschiedene Allele existieren, die für Proteine codieren, die an die Methyltransferasen binden und sie modifizieren könnten. Auch zytoplasmatische Faktoren könnten einen Teil zu diesen Imprinting-Phänomenen beitragen. Zytoplasmatische Effekte sind in Organismen mit relativ großen Ei-Zytoplasmen, wie Amphibien oder Insekten bekannt. Solche Einflüsse auf die Aktivität der einzelnen parentalen Allele wurde u.a. in Fischen (Schmidke et al., 1976), Fröschen (Wright et al., 1968), Drosophila (Bedichek Pipkin et al., 1970), Vögeln (Castro-Sierra et al., 1968) und Pflanzen (Chao et al, 1971) beobachtet. Es ist nicht auszuschließen, daß parentale Effekte durch nukleozytoplasmatische Interaktionen zu lang anhaltenden epigenetischen Modifikationen der Chromosomen führen können (Reik, 1992).
Die stamm-spezifischen Modifier und die dominante imprinted Transgen-Methylierung in Säugetieren zeigt zudem starke Parallelen zur "position effect variegation (PEV)" in Drosophila (McGowan et al., 1989; Allen et al., 1990; Sapienza, 1990; Peterson & Sapienza, 1993). Im allgemeinen versteht man unter einer PEV eine Änderung der Gen-Expression, basierend auf dessen geänderter Position innerhalb eines Chromosoms, z.B. durch eine Umgruppierung eines sich normalerweise im Heterochromatin lokalisierten Gens neben einen euchromatischen Bereich. (Übersicht bei Spofford, 1976, Henikoff, 1995). Die Expression von einem neu gruppierten white-Locus und anderen veränderten Loci in Drosophila wird durch eine Reihe von Faktoren beeinflußt, die mit der Ausnahme von DNA-Methylierung (welche in Drosophila nicht bekannt ist) denen der Modifier gleichen. Dazu gehört ein Expressions-Mosaizismus (Spofford, 1976), eine eltern-spezifische Beinflussung der Chromosomen-Umordnungen (Solter, 1988) und die Kontrolle durch dominante, modifizierende Loci (Sapienza, 1989b). Der möglicherweise interessanteste Mechanismus bei PEV ist, daß manche Umordnungen verstärkt werden, wenn die Transmission durch das Ei erfolgt, konträr zur verminderten Umordnung nach Transmission durch das Spermium.
Fast alle zur Zeit bekannten PEV-Modifier in Drosophila reagieren auf Gen-Dosis Effekte (Locke et al., 1988; Tartof & Bremer, 1990) und lassen sich in zwei Modifier-Klassen einordnen. Modifier der Klassse I sind Verstärker, Modifier der Klasse II Suppressoren der PEV-Wirkung. Bisher sind fast nur Klasse I-Modifier, wie das Hp1-Protein bekannt und isoliert worden (James & Elgin, 1986; Reuter et al., 1990). Hp1 ist eine strukturelle Komponente des Heterochromatins und enthält eine hoch konservierte Chromobox-Domäne, welche sich auch in Genen aus Mensch und Maus finden läßt (Singh et al., 1991; Eissenberg et al., 1992). Es wurde vorgeschlagen, daß die Existenz der Domäne möglicherweise für die Inkorporation von Proteinen in das Heterochromatin essentiell ist (Messmer et al., 1992; P. Singh, pers. Kommunikation).
Beobachtungen an der Expression von Transgenen in Fischen (Zebrafisch, Danio/Brachydanio rerio), zeigten die Wirkung von ähnlichen Modifiern in nicht-Säugetier Vertebraten (Stuart et al., 1990). Es wurde u.a. gezeigt, daß in transgenen Zebrafischen (enthalten das Plasmid pUSVCAT, Martin & McGowan, 1991, 1995) neben stamm-spezifischen Faktoren, PEV-ähnlichen Effekten auch Formen von gametischer Prägung existieren. Direkte Beweise dafür, ob die hier beschriebenen Modelle zutreffend sind, konnten jedoch noch nicht erbracht werden.
Teil A:
Methylierungsmuster in der "imprinted"-Region 15q11-13
Obwohl keine exakten Regulationsmechanismen, die eine Rolle in der allel-spezifischen Gen-Expression spielen, bekannt sind, scheint es klar, daß die DNA-Methylierung ein essentieller Bestandteil dieser gametischen Prägung ist. Für ein annäherndes Verständnis des Imprinting-Phänomens ist es damit unerläßlich jene Vorgänge zu studieren, die eine Etablierung und Weitergabe von allel-spezifischer Methylierung bedingen. Ein Teil dieser Studien muß daher der Beobachtung von spezifischen Methylierungsmustern in solchen, gametisch geprägten DNA-Regionen gelten. In dieser Arbeit sollten demzufolge mehrere chromosomale Bereiche der gametisch geprägten Region auf dem menschlichen Chromosom 15q11-13 hinsichtlich der Methylierungsmuster und iherer allelischen Verteilung untersucht werden.
Zu Anfang der Arbeit sollte zuerst eine Bisulfit-Methode aus vorhandenen Techniken zur Bisulfit-Sequenzierung weiterentwickelt werden, die den Ansprüchen der Untersuchungsschwerpunkte genügen. Mit Hilfe dieser Methode sollten dann drei DNA-Bereiche genomisch sequenziert werden, die alle innerhalb der für das Prader-Willi und das Angelman Syndroms kritischen Region zu liegen scheinen.
Eines dieser Bereiche ist der AS-SRO (Angelman syndrome – smallest region of deletion overlap), ein Element des sogenannten Imprinting-Centers. Mikrodeletionen in diesem Bereich führen dazu, daß die betroffenen Personen an dem Angelman Syndrom erkranken. Das Imprinting-Center oder IC-Element scheint möglicherweise für die Wiederherstellung des Imprints in der Keimbahn notwendig zu sein (Reis et al., 1994; Buiting et al., 1995; Saitoh et al., 1996). Solche IC Mutationen können unbemerkt durch die Keimbahn eines Geschlechts weitergegeben werden und manifestieren sich nur nach Transmission durch die Keimbahn des anderen Geschlechts. Die Folge ist ein maternales Chromosom mit paternalen Epigenotyp und paternale Chromosomen mit maternalem Epigenotyp. Es existieren mehrere theoretische Modelle, in denen die DNA-Methylierung des IC-Elementes und besonders des AS-SRO, für die Etablierung des Imprints auf Chromosom 15 notwendig ist. Eine Aufklärung der Methylierung innerhalb des AS-SRO könnte somit zu einem besseren Verständnis der gametischen Prägung führen.
Zur Zeit ist noch nicht genau bekannt, wie weit sich die kritischen DNA-Regionen, die für die Entstehung von Prader-Will- oder Angelman Syndrom verantwortlich sind, auf Chromosom 15q11-13 erstrecken. Die Grenze zwischen den beiden Bereichen verläuft etw 350 kBb telomerisch zum AS-SRO. Die genomische Sequenzierung dieses Grenzbereiches, hier als PASSR (PWS/AS seperating region) bezeichnet, sollte daher Rückschlüsse darauf zulassen, wo die Grenze der möglicherweise allelisch-reziprok geprägten DNA-Regionen zu finden ist.
Die dritte chromosomale Region, die in dieser Arbeit auf den Methylierungsstatus untersucht werden sollte, liegt etwa 10 kBb centromerisch zum erwähnten AS-SRO und wird als Y48.5 bezeichnet. Dieser Bereich wird auch häufig als Sonde für diagnostische Anwendungen verwendet. Einige dort gelegenen CpG-Dinukleotide scheinen eine für diese Region ungewöhnliche, paternal-spezifische Methylierung zu besitzen. Es zeigt sich jedoch, daß diese DNA-Region nur partiell sequenziert ist, daher sollte ein Teilabschnitt für diese Arbeit neu sequenziert werden. Der Marker Y48.5 liegt zudem zwischen mehreren sogenannten BD-Exons des SNRPN-Gens. Diese Exons werden im Soma paternal-spezifisch transkribiert und könnten eine entscheidende Rolle in der Entstehung der gametischen Prägung spielen. Es ist nicht auszuschließen, daß die ungewöhnliche Methylierung von Y48.5 die Transkription dieser Exons beeinflußt.
Die Untersuchung der speziellen Methylierungsmuster der drei zu untersuchenden Regionen könnte weiterhin Hinweise auf den Mechanismus geben, wie eine allel-spezifische Methylierung in einem Gewebe weitergegeben wird. Vorherige Daten aus diesem Labor konnten bereits andeuten, daß möglicherweise gametisch-geprägte DNA-Abschnitte existieren (PW71) , die einen gewissen Grad an klonaler Heterogenität zeigen (Zeschnigk et al., 1998).
Die genomische Sequenzierung der drei erwähnten chromosomalen Abschnitte könnte somit zu einem besseren, allgemeinen Verständnis von DNA-Methylierung und gametischer Prägung führen.
Teil B:
Stamm-spezifischer Methylierungsstatus eines pAd2E2AL-CAT-Transgens in Mäusen.
Frühere Arbeiten aus diesem Labor (Koestier et al., 1996) konnten zeigen, daß das pAd2-E2AL-CAT-Transgen 7-1A spezifisch in Abhängigkeit vom genetischen Hintergrundes eines Maus-Stammes methyliert wird. Es wird vermutet, daß für die Regulation dieser Methylierungs-Phänomene bestimmte epigenetische Loci verantwortlich sind, die unter Umständen auch eine wichtige Rolle in der Entstehung gameticher Prägung spielen könnten. Da jedoch keinerlei sicheres Wissen über die Natur von solchen Modifiern existiert gilt es nun, solche Modifier oder andere Faktoren zu charakterisieren, welche in der epigenetischen Kontrolle der Gen-Regulation involviert sind, um so zu ermöglichen, diese Elemente auf lange Sicht zu isolieren. Als experimentelle Basis dient dazu das transgene Maus-Modell, an dem die Wechselwirkungen zwischen Modifier-Aktivität und Transgen-Methylierung verfolgt werden sollen. Der erste Ziel dieser Arbeit soll daher die detaillierte Analyse der Methylierungsmuster des 7-1A-Transgens in den verschiedenen Mauslinien sein. Drei wesentliche, häufig in Laboratorien verwendete Maus-Stämme stehen dabei im Zentrum der Beobachtung. Ein DBA/2-Stamm, der eine Demethylierung des 7-1A-Transgens bedingt; - weiterhin ein Balb/c- und eine C57BL/6-Stamm, deren genetischer Hintergrund eine deutliche de novo Methylierung des 7-1A-Transgens verursachen. Eine wesentliche Fragestellung ist in diesem Zusammenhang, wie sich die Stabilität der einzelnen Methylierungs-Phänotypen über eine große Anzahl aufeinanderfolgender Generationen verhält. Um solche Beobachtungen zu gewährleisten, wurden mehrere trangene Inzucht-Mauslinien etabliert, die über mindestens zehn Rückkreuzungs-Generationen analysiert werden sollten. Nach Abschluß der meisten Kreuzungen sollte das jeweilige Inzucht-Genom einen spezifische Reinheit von über 99.9% aufweisen. Die Durchführung dieser Experimente sollte weiterhin klären, ob sich die beobachteten Phänotypen so deutlich voneinander unterscheiden, daß sie in Kreuzungen verschiedener Mausstämme in den Nachkommen eindeutig als stamm-spezifischer Phänotypen zu charakterisieren sind. Lassen sich die Methylierungs-Phänotypen eindeutig charakterisieren, so sollte mit Hilfe der Segregationsmuster der Transgen-Methylierung eine Isolierung möglicher Modifier möglich sein.
In mehreren Studien konnte gezeigt werden, daß verschiedene Transgene häufig in den gleichen Maus-Stämmen de novo methyliert, beziehungsweise demethyliert werden (Hadchouel et al., 1987; Sapienza et al., 1989; Allen et al., 1990; Koetsier et al., 1996). Um zu zeigen, ob solche Korrelationen zwischen Transgen-Insertion und genetischem Hintergrund reproduzierbar sind, sollte auch der Methylierungsstatus des 7-1A-Transgens in anderen, zuvor nicht analysierten Maus-Stämmen untersucht werden. Daher sollte das hypomethylierte 7-1A Transgen aus dem genetischen DBA/2-Hintergrund in drei weitere Maus-Stämme eingekreuzt werden. Ein FVB/N-Stamm, der mehrfach mit einer Demethylierung von transgenen in Verbindung gebracht wurde, ein CB20-Stamm und der Stamm 129 zu dem auch Vergleichsadaten mit andern Transgenen existieren.
Die Kreuzung des hypomethylierten Transgens in einen B6-DBA/2-Hybrid-Stamm könnte weiterhin Hinweise darauf liefern, wieviele hypothetische Modifier auf die Transgen-Methylierung einwirken. Etwa 30 Mäuse aus der Kreuzung (C57BL/6 x DBA/2)F1 x 7-1A-DBA/2 sollten daher auf Segregation der stamm-spezifischen Methylierungsmuster analysiert werden.
Die detaillierte Analyse zur Entstehung von Methylierungsmustern anhand der Transgen-Methylierung kann eine essentielle Rolle für ein besseres Verständnis epigenetischer Effekte liefern. Es ist möglich, daß die epigenetische Kontrolle durch DNA-Methylierung einen wichtigen Einfluß auf die Entwicklung eines Organismus ausübt und auch mit der Entstehung von genetischen Krankheiten und Krebs assoziiert ist. Generell ist die variable Entstehung und Vererbung von vielen genetischen Krankheiten durch epigenetische Mechanismen der Gen-Kontrolle beieinflusst, zu der auch die DNA-Methylierung zählt. Zusätzlich sollte ein besseres Verständnis der Faktoren, die die Gen-Expression von exogen hinzugefügter DNA zu einem etablierten Genom beeinflussen, in der Entwicklung von sinnvollen Protokollen zur Gen-Therapie mithelfen. Die hier vorgestellte Arbeit soll jedoch nur als Anfang einer genauen Untersuchung eines transgenen Maus-Modells stehen. Auf weite Sicht sollte es möglich sein Gene, welche die DNA-Methylierung und Gen-Expression beeinflussen, zu charakterisieren, kartieren und letztendlich zu klonieren.